Dr.Öğr.Üyesi Diğdem Yöyen Ermiş

CXCL Kemokin Öncül Dizilerinden Türevlenen Özgün Küçük Peptit Moleküllerinin, Kanser İlişkili Miyeloid Baskılayıcı Hücreleri Hedefleyerek ''Kanser İmmünterapisi''nde Kullanımı

Tümör gelişimi sırasında bozulan doku fizyolojisi, tümör hücreleri tarafından salgılanan faktörler ve gelişen inflamasyon nedeni ile immün ve stromal hücrelerin karakterleri değişir. Bu hücreler kanser gelişimini desteklemeleri nedeniyle, “tümör-ilişkili” olarak adlandırılmaktadırlar. Tümörün büyümesi ve/veya evresinin ilerlemesi ile oluşan kütlenin içerisine yerleşen tümör-ilişkili hücrelerin miktarı da artmaktadır (Faurobert vd., 2015; Visvader, 2011). Tümör dokusuna yerleşmiş bulunan hücrelerden özellikle makrofaj/monosit, miyeloid-kökenli baskılayıcı hücreler (MKBH) ve nötrofiller (Marvel & Gabrilovich, 2015)  neo-anjiyogenez, antitümör yanıtların baskılanması, tümör gelişimi ve yayılması için gerekli faktörlerin ve bağ dokunun sağlanması gibi kanserleşme için kritik fonksiyonlar görür (Marvel & Gabrilovich, 2015; De Vlaeminck vd., 2016; Gunderson & Coussens, 2013; Tosolini vd., 2011; Kalluri & Zeisberg, 2006; Pietras & Östman, 2010).  Tümör mikroçevresinde bulunan miyeloid kökenli hücrelerden özellikle tümör-ilişkili makrofajlar (tumor associated macrophages, TAM) ve miyeloid kökenli baskılayıcı hücreler (myeloid derived suppressor cells, MDSC) hem tümör dokusunda hem de periferde yetersiz immün uyarım ve/veya immün baskılama yaparak özellikle T hücre yanıtlarını sekteye uğratırlar. Bu hücrelerin taşıdığı belirteçler bilinse de, gerek normal miyeloid hücreler tarafından da paylaşılmaları gerekse farklı patolojik durumlarda değişkenlik (heterojenite) göstermeleri nedeniyle sınırlı verimliliğe (güvenilirlik ve tutarlılığa) sahiptir. Bu nedenle bu hücrelerin hedeflenmesi verimli olarak sağlanamamaktadır. Kanser ve diğer önemli kronik inflamatuvar hastalıkların immünolojik olarak düzenlenmesi sırasında miyeloid kökenli hücrelerin kilit rol üstelendiği bilinmektedir. Hastalık ilerleyişi ile ilgili fikir vermesi veya tedavi amacı ile bu hücrelerin takibi veya hedeflenmesi günümüz sağlık bilimleri ve teknolojilerinin ilgi alanları arasında yer alır.

Günümüzde pek çok kanser tipi için gerek bilimsel literatür gerekse biyoinformatik veritabanları kullanılarak yeni hedefli molekül tedavileri geliştirilmeye çalışılmaktadır. Yaptığımız çalışmalarda bilinen 17 adet CXCL kemokin molekülünün öncül dizileri rasyonel bir algoritma ile irdelemiş, bu dizilerden türevlenen küçük peptit molekülleri belirlenmiş, in vitro kullanıma uygun olacak ve sentezlenmesi mümkün peptitler seçilmiştir. Peptit yapılı küçük moleküller pek çok fizyolojik sürecin düzenlenmesinde ve hücrelerarası iletisimin sağlanmasında rol alır. Öncül proteinlerin proteolitik enzimler ile işlenmesi sırasında koparılan ‘öncül peptit dizileri’ nedeniyle pek çok küçük peptit açığa çıkar. Özellikle, CXCL yapısını paylaşan kemokinlerinin aktif forma dönüşürken proteolitik enzimler ile işlendiği bilinmektedir. İmmün yanıtlar sırasında üretilen proteazlar CXCL kemokinlerine ait öncül peptitlerin yüksek miktarda açığa çıkmasına neden olur. Yaptığımız ilk deney sonuçlarında, CXCL kemokinlerine ait öncül peptit dizilerinden türevlenen küçük moleküllerin immün yanıtları etkileyebilecegi hipotezi test edilmiştir. Bu savımızı desteklemek üzere gerçekleştirilen deneyler ile, ilk olarak CXCL kemokinlere ait öncül peptit dizileri yeni bir in silico biyoinformatik algoritma ile değerlendirilerek biyoaktif diziler belirlenmiştir. Belirlenen bu CXCL öncül peptit türevleri sentezletilerek; periferik kan mononükleer (PKM) hücreleri ile inkübe edilmiş ve bu hücrelerin; proliferasyon, aktivasyon, sitokin sekresyonu gibi yanıtlarını arttırıcı veya azaltıcı yönde etki ettiği görülmüştür. Bu etkiye sahip umut verici ‘’özgün’’ üç adet peptit sekansı bulunmuştur.  İlgili CXCL kemokininden türevlenen küçük peptit molekülü çalışmada Pep olarak kısaltılmıştır (Örneğin, CXCL8 kemokininden türevlenen küçük peptit molekülü Pep8 olarak isimlendirilmiştir). Bu peptitlerin immün yanıtları düzenlemenin yanı sıra hücresel hedeflenmede kullanabileceği düşünülmüş ve bununla ilgili deneyler gerçekleştirilmiştir. İmmün hücrelerden özellikle miyeloid seri hücrelerine girebildiği gözlenen bu peptitlerin ‘’kanser ilişkili miyeloid hücreleri’’ hedefleyebileceği düşünülmüştür. Bu hücrelerden Miyeloid-kökenli baskılayıcı hücreler (MDSC) ve Tümör-ilişkili Makrofajlar (TAM), miyeloid hücre gelişiminin farklı olgunlaşma basamaklarını yansıtan heterojen bir gruptur. Bu hücrelerin ilgili peptitler ile hedeflenebileceği hipotezini test etmek amacı ile farklı olgunlaşma basamaklarında bulunan miyeloid hücreler kullanılmak istenmiş ve Akut Miyeloid Lösemi (AML) hücre hatları ile etkileşim deneyleri gerçekleştirilmiştir. Miyeloid lösemiler farklı olgunlaşma basamaklarında bulunan miyeloid hücreleri yansıttığı için bu kanser tipinin hücre hatları miyeloid hücre çalışmalarında model olarak kullanılmaktadır. Ayrıca, bu hücreler sınırsız çoğalma ve in vitro farklılaşma kapasitesine sahiptir (Koeffler vd., 1980; Rucker vd., 2006). Özellikle, THP-1 hücre hattı literatürde en çok kabul gören monositik hücre hattıdır (Bosshart vd., 2016). Bunun dışında KG-1, Kasumi-1, HL-60 ve U937 de farklı olgunlaşma basamaklarını yansıtan AML hücre hatlarıdır. KG-1 ve Kasumi-1 miyeloblastik hücre kategorisinde yer alan M0 farklılaşma düzeyindeki hücrelerdir (Albright vd., 2013). HL-60, M2/M3 düzey farklılaşmaya sahip olup, in vitro miyeloid farklılaşma çalışmalarında sıklıkla tercih edilir (Dolen ve Esendağlı 2013). U937 ise en ileri düzeyde farklılaşmaya sahip histiyositik hücre hattıdır (Harris vd., 1985; Koren vd., 1979). İlgili peptitlerin farklı düzeylerde AML hücre hatlarına alınabildiği ve bu alımda farklı endositoz mekanizmalarının (Makropinositoz, Klatrin-aracılı endositoz ve Kaveol aracılı endositoz) kullanıldığı görülmüştür. Tüm bu ön çalısmalardan elde edilen bulgular ile hem inflamatuvar yanıtların düzenlenmesi hakkında yeni bilgiler elde edilmiş hem de bu bilgilerin kanser hücrelerini hedeflemede kullanılabileceği ortaya çıkartılmıştır. Elde ettiğimiz bu ön sonuçlar ile, özgün sekansını belirlediğimiz küçük peptitlerin farklı olgunlaşma basamaklarında bulunan ‘’kanser ilişkili miyeloid-hücreleri’’ hedeflemek için hedefleyici sistemler olduğunu önermekteyiz. Bu sayede ilgili miyeloid hücreler hedeflenerek ‘’kanser ilişkili miyeloid hücreler’’ aracılı baskılanmış immün yanıt ekarte edilerek immün sistemin tekrar kanseri yok etme yönünde aktive edilmesi hedeflenmektedir. Literatürde birçok küçük peptit molekülü tanımlanmıştır. Fakat, özellikle monositik hücreleri hedefleyebilen bir peptit bulunmamaktadır. Bu nedenle AML hücre hatlarında gözlemlediğimiz sonuçları kanser hastalarından elde edilen miyeloid hücreler üzerinde de göstermeyi amaçlamaktayız.

Bu çalışma ile ‘’Kanser İmmünoterapisi’’ tedavi alanında umut verici sonuçlar elde edebilmek adına ilk büyük adımın atılacağını düşünüyorum. Ön deneylerin sonuçları doğrultusunda önerdiğim devam niteliği taşıyan projede, akım sitometri ve floresan mikroskopi kullanılarak ilk etapta etkileşim deneyleri tamamlanacaktır. Böylece hangi peptitin hangi ‘’kanser ilişkili miyeloid hücre’’ ile etkileştiği netleştirilecektir. Akım sitometri yöntemi ile ilgili peptitlerin ‘’kanser ilişkili miyeloid hücre’’ ölümü üzerine bir etkisinin olup olmadığı AnnexinV/PI boyaması yapılarak belirlenecektir. Ayrıca, mitokondri membran potansiyeli de JC-1 boyası (Mitochondrial Membrane Potential Probe) ile floresan mikroskopi ile değerlendirilerek hücre ölümü üzerine olabilecek etkiler faklı yöntemler ile doğrulanacaktır. Böylelikle, ilk etapta çıplak peptit moleküllerinin biyoaktivitesi değerlendirilecektir. Bu kapsamda sitokin salımı ve proliferasyon deneyleri yapılarak ‘’tümör ilişkili miyeloid hücreler’’de meydana gelen immün yanıt değişiminin hangi yönde olacağı belirlenecektir.

İlgili küçük peptit moleküllerinin bu etkileri değerlendirilerken, farmasötik teknolojik yöntemlerden faydalanılırak stabilitasyonunun arttırılması büyük önem arz etmekte olup, bu konudaki çalışmalarımız halen devam etmektedir.

Son aşamada ise, ilgili peptitler ile inkübe edilmiş veya edilmemiş ‘’kanser ilişkili miyeloid hücre’’ler ve sağlıklı donörlerden elde edilmiş PKM (Periferik kan mononükleer) hücreleri ile ko-kültür deneyleri kurularak T hücre proliferasyonları değerlendirilecektir. Bu deneylerde PKM (Periferik kan mononükleer) hücreleri Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) ile işaretlenerek peptitlerin varlığında veya yokluğunda AML blastları ile 96 kuyulu hücre kültür kaplarında 72 saat boyunca kültür ortamında tutulacaktır. İnkübasyonun sonunda santrifüj edilen koşullar (1800rpm, 5 dakika, +4°C) süpernatantlar toplanarak ileride değerlendirme ihtimali için -80°C’de saklanacaktır. Hücreler ise, akım sitometri cihazında analiz edilerek proliferasyon kapasiteleri değerlendirilecektir. Böylelikle anti-tümör immün yanıtların ilgili peptitler sayesinde tekrar aktive edilip edilemediği değerlendirilecektir.

İlgili peptitlerin solid tümörlerde kanser ilişkili makrofaj (tumor-associated macrophage, TAM) veya miyeloid kökenli baskılayıcı hücrelerin (myeloid derived suppressor cells, MDSC) hedeflenmesinde kullanılabileceğini öngörmekteyim. Bu peptitlerin hücre tespiti veya modifikasyonlar ile terapötik olarak kullanılma amaçlı dizaynları için geliştirilecek yöntem ve analizler çok kritiktir. Önceki çalışmaların üzerine yapılacak önerdiğim ek deneyler ile araştırma verileri kuvvetlendirilip, detaylandırılarak tümör veya ilişkili immün hücre tespiti sayesinde özellikle immünoterapide umut vaat edici yeni ve özgün moleküller ortaya çıkarılacaktır. Tüm bu çalışmalara ışık tutabilmesi için tarafınıza sunduğum araştırma projesinin içerdiği kapsamdaki yapılmış ve yapılacak deneyler kanser tedavisinde yeni bir tedavi stratejinin geliştirilebilmesi için anahtar role sahiptir.    

İlgili çalışmanın deney sonuçlarını ekteki dökümanda görebilirsiniz.

* Bu çalışmanın yukarıda belirtilen ilk sonuçları, TÜBİTAK – Kimya Biyoloji Araştırma Destek Grubu (KBAG) tarafından desteklenerek, Araştırma Destek Programları Başkanlığı (ARDEB) 1001 programı kapsamında elde edilmiştir (Proje no: 113Z061).* Önceki deneylerden elde edilen sonuçlardan en çarpıcı olanlar bu belgede tarafınıza sunulmuştur.* Elde edilen pozitif sonuçlar neticesinde ilk olarak belirlenen peptitlerin uluslararası patent başvurusu gerçekleştirilmiştir (PCT/TR2016/050230).* Çalışma TÜBİTAK – 2214/A Yurt Dışı Doktora Sırası Araştırma Bursunu almaya layık görülmüştür (Department of Otorhinolaryngology Research Division, Universitätsklinikum Essen , Prof. Dr. Sven Brandau Lab, Essen, Almanya)